标记基因筛选原理（标记基因）

标记基因（标记基因筛选原理）

专题1 基因工程

基因工程的概念

基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。

概念分析

①基因工程技术的原理=基因重组

②目的：创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。

③操作水平：DNA分子水平

属于有性生殖

（一）基因工程的基本工具

1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）

（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。

（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。

（3）结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端（回文结构特点）。

2.“分子缝合针”——DNA连接酶

(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比较：

①相同点：都缝合磷酸二酯键。

②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。

(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。

3.“分子运输车”——载体

（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。

②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。

③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。

④大小合适，具有一定的安全性。

（2）最常用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。

（3）其它载体： 噬菌体的衍生物、动植物病毒

4．在进行基因工程操作中，真正被用作载体的质粒，都是在天然质粒的基础上进行过人工改选的。

(二)基因工程的基本操作程序

步骤：目的基因的获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的检测与鉴定

第一步：目的基因的获取

1.目的基因是指： 编码蛋白质的结构基因 。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.PCR技术扩增目的基因

（1）PCR是聚合酶链性反应的缩写，发明人：穆里斯等人

原理：DNA双链复制 实质：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。

（2）过程：第一步：（变性）加热至90～95℃DNA解链；第二步：（复性）冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：（延伸）加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。

PCR利用DNAR 热变性原理，PCR扩增仪实质上是一台能够自动调控调控的仪器。

4，获取目的基因的方法：从自然界中已有的特种中分离及人工合成。

第二步：基因表达载体的构建

1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因

（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。

（3）标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步：将目的基因导入受体细胞_

1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法：

将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有 基因枪法和 花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是 受精卵（也可以是卵细胞）。

将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步：目的基因的检测和表达

1.首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。

基因探针：是指用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子

2.其次还要检测 目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用 用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。

3.最后检测 目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取 蛋白质，用相应的 抗体进行抗原－抗体杂交。

4.有时还需进行 个体生物学水平的鉴定。如 转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。

（三）基因工程的应用

1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物，利用转基因改良植物的品质。

①抗虫棉，抗盐碱地的农作物，耐寒的番茄，抗除草剂的玉米，

②富含赖氨酸的转基因玉米

2.动物基因工程：提高动物生长速度、改善畜产品品质、用转基因动物生产药物。

①③④导入人的生长激素的鲤鱼，比一般的鲤鱼长的快且大。

②用转基因动物生产药物：乳腺生物反应器（乳房生物反应器）

最令人兴奋的是利用基因工程技术，使哺乳动物本身变成“批量生产药物的工厂”

大概过程：目的基因（蛋白基因+乳腺蛋白基因的启动子） 显微注射方法 导入哺乳动物受精卵 母体子宫内 能产生药品蛋白质转基因动物

能产生如：抗凝血酶，血清白蛋白，生长激素，抗胰蛋白酶，等大量蛋白质类药品。

3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内，使该基因表达产物发挥作用。

基因诊断：是指用基因探针，利用DAN分子杂交原理，鉴定被检测样本上的遗传信息，从而达到检测病症的目的，如镰刀形贫血症，苯丙酮尿症，癌症

基因治疗：基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗病症的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。

基因治疗包括：体外基因治疗和体内基因治疗

微生物的基因工程：

利用转基因工程菌生产药物：如细胞因子，抗体，疫苗，激素（胰岛素），干扰素等，已形成工业化。

工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系一般称为工程菌。

转基因动物作器官移植的供体：最大的难题是解决免疫排斥问题

（四）微生物在基因工程中的应用研究

工具酶主要来自微生物， 最重要的目的基因供体库之一， 目的基因的载体之一

作用受体细胞， 提供用于发酵的工程菌。

基因工程的优点：克服不同生物远缘杂交的障碍。目的性强，能够定向的改变生物的品质。

缩短育种周期。

（五）蛋白质工程的概念

蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质）

专题2 细胞工程

细胞工程：是指导应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞水平或细胞器水平上的操作，按照人的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术，

根据操作对象不同分为：植物细胞工程，动物细胞工程

操作水平：细胞水平的操作

（一）植物细胞工程 （属于无性繁殖）

无性繁殖最大优点：保持优良品种的遗传特征。

1.理论基础（原理）：细胞全能性（具有某种生物全部遗传信息的任何一个细胞都具有发育成完整生物体的潜能，也就是说，每个生物细胞都具有全能性的特点，）

植物具有全能性的原因：分化的细胞，仍具有形成完整植株所需要的全部基因。

全能性表达的难易程度：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞动物细胞

理论上，生物的任何一个细胞都具有发育成完整植物的潜力，但是在生物的生长发育过程中，细胞并不会表现出全能性，而是分化成各种器官和组织，是因为在特定的时间和空间条件下，

植物细胞工程的基本技术：植物组织培养，植物体细胞杂交技术

2.植物组织培养技术

（1）过程：

离体的植物器官、组织或细胞 脱分化 愈伤组织 再分化 试管苗 ―→植物体

（外植体消毒） 生长素及细胞分裂素 （避光） 生长素及细胞分裂素（给光）

植物全能性表达的条件：离体的，提供人为条件（营养，激素，适宜的外界条件）

愈伤组织：细胞排列疏松而无规则是一种高度液泡化的呈无定形状态的薄壁细胞

培养基：固体培养基，含有矿质元素，碳源（蔗糖），氮源，植物激素，维生素

（2）植物组织培养技术的应用：探究植物科学理论的重要手段，微型繁殖、培养脱毒苗、生产人工种子、培养新品种（单倍体育种）、转基因植物的培养，细胞产物的工厂化生产。

（3）地位：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序。

3.植物体细胞杂交技术

（1）过程：

原生质制备 细胞融合 杂种细胞筛选 细胞培养 组织培养技术

植物鉴定 植物再生

（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电刺激等。

化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂。

（3）去细胞壁：纤维素酶和果胶酶 等到杂种细胞再生出细胞壁即细胞杂交结束，

意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍。打破特种之间的生殖隔离，扩大遗传重组范围。

微型繁殖的优点：可以保持优良品种的遗传特性，可以高效快速地实验种苗的大量繁殖

人工种子的优点：无性繁殖，完全保持优良品种的遗传特性，不受季节限制，方便运输及贮藏

单倍体育种的优点：极大缩短了育种的年限，节约了大量的人力物力。

（二）动物细胞工程

常用的技术手段：动物细胞培养，动物细胞核移植，动物细胞融合，生产单克隆抗体。其中动物细胞培养技术是基础技术

1. 动物细胞培养

（1）概念：动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和繁殖。

（2）动物细胞培养的流程：取动物组织块（动物胚胎或幼龄动物的器官或组织）→剪碎→用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理分散成单个细胞继续传代培养。

（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，称为细胞贴壁。细胞数目不断增多，当贴壁细胞分裂生长到表面相互抑制时，细胞就会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。

（4）动物细胞培养需要满足以下条件

①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处理。通常还要在培养液中添加一定量的抗生素，以防培养过程中的污染。此外，应定期更换培养液，防止代谢产物积累对细胞自身造成危害。

②营养：合成培养基成分：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等。通常需加入血清、血浆等天然成分。

③温度：适宜温度：哺乳动物多是36.5℃＋0.5℃；pH：7.2～7.4。

④气体环境：95%空气＋5%CO2。O2是细胞代谢所必需的，CO2的主要作用是维持培养液的pH。

（5）动物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、 制备单克隆抗体、 检测有毒物质、 培养医学研究的各种细胞。

2.动物体细胞核移植技术和克隆动物

（1）哺乳动物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比较容易）和体细胞核移植（比较难）。

（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比较大，容易操作；卵(母)细胞细胞质多，营养丰富。

（3）体细胞核移植的大致过程是：（右图）

（4）体细胞核移植技术的应用：

①加速家畜遗传改良进程，促进良畜群繁育； ②保护濒危物种，增大存活数量；

③生产珍贵的医用蛋白； ④作为异种移植的供体；

⑤用于组织器官的移植等。

（5）体细胞核移植技术存在的问题：

克隆动物存在着健康问题、表现出遗传和生理缺陷等。

3.动物细胞融合

（1）动物细胞融合也称细胞杂交，是指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞，称为杂交细胞。

（2）动物细胞融合与植物原生质体融合的原理基本相同，诱导动物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似，常用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电刺激等。

（3）动物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性，成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物生物新品种培育的重要手段。

（4）动物细胞融合与植物体细胞杂交的比较：

4.单克隆抗体

（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。

（2）单克隆抗体的制备过程：

（3）杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。

（4）单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。

（5）单克隆抗体的作用：

① 作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。

② 用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。

专题3 胚胎工程

胚胎工程：是指对动物早期胚胎或配子所进行的多种显微操作和处理技术，如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术。经过处理后获得的胚胎，还需移植到雌性动物体内生产后代，以满足人类的各种需求。

胚胎工程的许多技术，实际是在体外条件下，对动物自然受精和早期胚胎发育条件进行的模拟操作。

（一）体内受精和早期胚胎发育

1、精子的发生

场所：睾丸（精巢） 时间：初情期—生殖机能衰退

阶段：精原细胞 有丝分裂 许多初级精母细胞 减数第一次分裂 次级精母细胞 减数第二次分裂

成熟的精子 变形 精细胞

变形：细胞核—-精子头的主要部分

高尔基体—-顶体 中心体—–尾 线粒体—-鞘膜 其它物质—原生质滴—脱落

精子的外形：似蝌蚪，分头，颈，尾三部分。精子的大小与动物的体型大小无关。

2卵子的发生

场所：卵巢 时间：性别分化以后（胎儿期）—（精子与卵子在发生时间上的差别是重要的区别）

减数第一次分裂是在雌性动物排卵前后完成的，其结果产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管，准备与精子受精（不同的动物排卵的时间不同）。意思是排出的卵细胞是次级卵母细胞，不是成熟细胞。

减数第二次分裂是在精子和卵子结合的过程中完成的，当卵黄膜和透明带的间隙可以观察到两个极体时，说明卵子已经完成了受精，这是判断卵子是否受精的重要标志。

3受精：

场所：雌性的输卵管内完成的

准备阶段1：精子获能：刚排出的精子不能立即与卵子受精，必须在雌性动物生殖道发生相应的生理变化后，才能获得受精能力

准备阶段2：卵子的准备：动物排出的卵子成熟程度不同，但都在要输卵管内进一步成熟，达到减数第二次分裂的中期，才具备与精子受精的能力。

受精阶段：过程主要包括：精子穿越放射冠，透明带，进入卵黄膜，原核形成和配子结合。

过程：通过顶体反应精子穿越放射冠（卵丘细胞群）—–接触透明带后穿越透明带接触卵黄膜（发生透明带反应）——精子与卵黄膜融合，精子进入卵（卵黄膜封闭作用）—–尾总脱离，核膜破裂形成雄原核，卵子完成减数第二次分裂，形成雌原核，两核结合，受精结束。

4、动物胚胎发育的基本过程

（1）卵裂期：特点：细胞有丝分裂，细胞数量不断增加，但胚胎的总体体积并不增加，或略有减小。

（2）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目达到32个左右时，胚胎形成致密的细胞团，形似桑椹。是全能细胞。

（3）囊 胚：特点：细胞开始出现分化（该时期细胞的全能性仍比较高）。聚集在胚胎一端个体较大的细胞称为内细胞团，将来发育成胎儿的各种组织。中间的空腔称为囊胚腔。

（4）原肠胚：特点：有了三胚层的分化，具有囊胚腔和原肠腔。

胚胎发育（受精卵—幼体）后，生物体进行胚后发育（胎儿—性成熟）

植物是从受精卵—-种子，胚后发育从种子——开发结果

（二）体外受精和早期胚胎培养

1 体外受精主要过程包括：卵母细胞的采集，精子的获取，和受精

(1)卵母细胞的采集和培养：

主要方法：用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取卵子，直接与获能的精子在体外受精。第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中采集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体动物的卵巢中吸取卵母细胞。采集的卵母细胞，都要在体外经人工培养成熟后，才能与获能的精子受精。

(2) 精子的采集和获能：假阴道法，手握法和电刺激法，在体外受精前，要对精子进行获能处理。培养法和化学诱导法两种（把精子放在人工配制的获能液中如肝素中）

(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程。

(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后，应将受精卵移入发育培养液中继续培养，以检查受精状况和受精卵的发育能力。培养液成分较复杂，除一些无机盐和有机盐外，还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成分，以及血清等物质。当胚胎发育到适宜的阶段时，可将其取出向受体移植或冷冻保存。不同动物胚胎移植的时间不同。(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才能进行移植，小鼠、家兔等实验动物可在更早的阶段移植，人的体外受精胚胎可在4个细胞阶段移植。)

2.胚胎移植

(1)胚胎移植是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其它方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其它雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。其中提供胚胎的个体称为“供体”，接受胚胎的个体称为“受体”。（供体为优良品种，作为受体的雌性动物应为常见或存量大的品种。）

地位：如转基因、核移植，或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎，都必须经过胚胎移植技术才能获得后代，是胚胎工程的最后一道“工序”。

（三）胚胎工程的应用及前景

1胚胎移植

（1 ） 胚胎移植：的指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及其他方式得到的胚胎，移植到同种的，生理状态相同的其他雌性动物的体内，使之继续发育为新个体的技术。

胚胎移植是胚胎工程其他技术的最后一道工序

（2） 胚胎移植的意义：大大缩短了供体本身的繁殖周期，充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。

应用：良种畜群迅速扩大，加速了育种工作和品种改良；胚胎移植不受时间和地域的限制，大量节省了购买种畜的费用；一次多胎或一次双胎；建立胚胎库，保存品种资源和濒危物种。

（3） 生理学基础：①动物发情排卵后，同种动物的供、受体生殖器官的生理变化是相同的。这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境。

②早期胚胎在一定时间内处于游离状态。这就为胚胎的收集提供了可能。

③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应。这为胚胎在受体的存活提供了可能。

④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系，但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响。

（4） 基本程序主要包括：

①对供、受体的选择和处理。选择遗传特性和生产性能优秀的供体，有健康的体质和正常繁殖能力的受体，供体和受体是同一物种。并用激素进行同期发情处理，用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处理。

②配种或人工授精。

③对胚胎的收集、检查、培养或保存。配种或输精后第7天，用特制的冲卵装置，把供体母牛子宫内的胚胎冲洗出来(也叫冲卵)。对胚胎进行质量检查，此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段。直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保存。

④对胚胎进行移植。

⑤移植后的检查。对受体母牛进行是否妊娠的检查。

2 胚胎分割

(1)概念：是指采用机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等，经移植获得同卵双胎或多胎的技术。

(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质，属于无性繁殖。

(3)材料：发育良好，形态正常的桑椹胚或囊胚。（桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。）

(4)操作过程：对囊胚阶段的胚胎分割时，要将内细胞团均等分割，否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育。

（四）胚胎干细胞

1、哺乳动物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来。

2、具有胚胎细胞的特性，在形态上表现为体积小，细胞核大，核仁明显；在功能上，具有发育的全能性，可分化为成年动物体内任何一种组织细胞。另外，在体外培养的条件下，可以增殖而不发生分化，可进行冷冻保存，也可进行遗传改造。

3、胚胎干细胞的主要用途是：

①可用于研究哺乳动物个体发生和发育规律；

②是在体外条件下研究细胞分化的理想材料，在培养液中加入分化诱导因子，如牛黄酸等化学物质时，就可以诱导ES细胞向不同类型的组织细胞分化，这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；

③可以用于治疗人类的某些顽疾，如帕金森综合症、少年糖尿病等；

④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性，移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；

⑤随着组织工程技术的发展，通过ES细胞体外诱导分化，定向培育出人造组织器官，用于器官移植，解决供体器官不足和器官移植后免疫排斥的问题。